aAFDye 647 NHS ester  

(Alexa Fluor 647 NHS ester Equivalent)

產(chǎn)品信息

產(chǎn)品描述

Dye 647是一種水溶性、強(qiáng)光穩(wěn)定性的染料，具非常高的光量子產(chǎn)量。AFDye 647是一種明亮的遠(yuǎn)紅外熒光染料，可使用633nm或647nm激光譜線進(jìn)行激發(fā)。適用于對(duì)低豐度靶標(biāo)進(jìn)行成像，尤其在固定細(xì)胞中。在pH 4-10范圍內(nèi)耐受性強(qiáng)。

AFDye647 NHS ester (Equivalent toAlexa Fluor 647 NHS ester）是一種胺反應(yīng)、發(fā)遠(yuǎn)紅外熒光的染料，通常通過(guò)伯胺來(lái)標(biāo)記蛋白或抗體、多肽、胺基修飾的寡核苷酸，以及其它含胺基生物分子。這一標(biāo)記通常在pH 7-9范圍zui有效，形成穩(wěn)定和共價(jià)酰胺鍵。

產(chǎn)品特性

保存與運(yùn)輸方法

保存：-20oC避光干燥保存，2年有效。

運(yùn)輸：冰袋運(yùn)輸。

注意事項(xiàng)

1） 熒光染料均存在淬滅問(wèn)題，請(qǐng)盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。

2） AFDye NHS ester系列染料雖有一定的水溶性，但，強(qiáng)烈推薦用DMSO、DMF溶解配制母液，再進(jìn)行后續(xù)的標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。因?yàn)椋谒苄泽w系中這些反應(yīng)性基團(tuán)非常容易被水解生成非反應(yīng)性的游離酸形式。

3） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

一、染色步驟（以免疫球蛋白IgG的標(biāo)記為例）

幾乎所有蛋白或多肽都能用胺反應(yīng)試劑（探針）來(lái)標(biāo)記。以下是針對(duì)IgG抗體而優(yōu)化的標(biāo)記步驟，用戶可根據(jù)自身蛋白量來(lái)放大或縮小反應(yīng)體系，但為了得到理想的染色結(jié)果，蛋白濃度不得小于2mg/ml。由于不同蛋白（多肽）所含胺基數(shù)目、胺基表面位置都有巨大差別，建議用戶在初次實(shí)驗(yàn)時(shí)，建立三組不同的胺反應(yīng)試劑：蛋白的摩爾比，以篩選出能達(dá)到zuijia標(biāo)記效率的摩爾比。

1.1 于1ml 0.1M碳suan氫鈉緩沖液充分溶解~10mg蛋白。

注① ：蛋白濃度通常為5-20mg/ml，偶聯(lián)的成功率對(duì)蛋白濃度具高度依賴性。當(dāng)濃度低于2 mg/ml，會(huì)嚴(yán)重影響標(biāo)記效率。

注② ：標(biāo)記體系應(yīng)避免任何含胺基底物，如Tris、glycine、銨鹽、或其他穩(wěn)定蛋白如BSA等，如待標(biāo)記的蛋白溶液中含有上述物質(zhì)的污染，則需透析到10-20 mM的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，再向每ml蛋白溶液中加入0.1 ml 1M碳酸氫鹽緩沖液（pH 8.3–9.0）調(diào)至所需pH值。

注③ ：抗體溶液中存在的低濃度疊氮鈉（＜3 mM）或硫汞撒（＜1 mM）不會(huì)干擾標(biāo)記反應(yīng)。

1.2 用高質(zhì)量無(wú)水DMF或DMSO溶解胺反應(yīng)試劑（探針）（比如：AFDye647 NHS ester）至10 mg/ml。

注①：AFDye 488 NHS ester的水溶液務(wù)必現(xiàn)配現(xiàn)用，不可保存，因其在水溶液中，會(huì)被水解成非活性游離酸。AFDye 488 NHS ester的DMSO儲(chǔ)存液可置于≤-20℃保存，建議2周內(nèi)用完。

1.3 一邊攪拌或渦旋蛋白溶液，一邊緩慢加入50-100 µl 胺反應(yīng)試劑（探針）。

注①：加入胺反應(yīng)試劑（探針）的量在0.5-1 mg，總的來(lái)說(shuō)，約1/4-1/3的胺反應(yīng)試劑會(huì)偶聯(lián)到蛋白上。不同的蛋白和標(biāo)記試劑的標(biāo)記效果不同，請(qǐng)根據(jù)具體情況優(yōu)化兩者比例。

1.4于室溫緩慢攪拌避光孵育1h（或更長(zhǎng)）。

1.5【可選】通過(guò)加0.1ml新鮮配制的1.5M羥胺（pH 8.5）來(lái)終止反應(yīng)，于室溫孵育含羥胺體系1h。

1.6純化：選擇一種合適的方式（比如：透析法、P-30柱子或PD-10柱）來(lái)純化標(biāo)記產(chǎn)物，去除鹽離子或未反應(yīng)的胺反應(yīng)試劑。

1.7貯存：標(biāo)記好的蛋白避光保存于2-8℃。若純化的蛋白偶聯(lián)物濃度＜1mg/ml，加入BSA或其它穩(wěn)定蛋白1-10mg/ml。在2mM疊氮鈉存在的情況下，2-8℃可保存幾個(gè)月。若需保存更長(zhǎng)時(shí)間，需分裝后于-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。

二、計(jì)算標(biāo)記比例（F/P值）

對(duì)于免疫球蛋白IgG等大多數(shù)抗體來(lái)說(shuō)，摩爾吸光系數(shù)為203000，F(xiàn)/P值在4～9之間是最合適。
2.1AFDye647標(biāo)記蛋白F/P值計(jì)算：
1）用PBS精確倍數(shù)稀釋定量的少許純化過(guò)的偶聯(lián)蛋白，在1cm比色皿中測(cè)定280nm和650nm的光吸收；
2）計(jì)算樣品中的蛋白濃度：蛋白摩爾濃度=(A280-(A650×0.03))×稀釋倍數(shù)/203000
3）計(jì)算標(biāo)記比例：每摩爾蛋白結(jié)合的染料摩爾數(shù)=A650×稀釋倍數(shù)/(239000×蛋白摩爾濃度)

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